双剑合璧 全新一代4D-DIA
本文由景杰学术团队原创解读
欢迎点击上方蓝字“景杰生物科技”关注我们
以质谱技术为核心的蛋白组学技术近些年取得了突破性的进展，比如离子淌度分离概念的引入使得蛋白质组学进入了4D新时代。4D蛋白质组学是在3D分离即保留时间（retention time）、质荷比（m/z）、离子强度（intensity）这三个维度的基础之上增加了第四个维度--离子淌度（mobility）的分离（图1），进而大幅度的提高扫描速度和检测灵敏度，带来蛋白质组学在鉴定深度、检测周期、定量准确性等性能的全面提升。
图1. 新一代4D蛋白质组学
尽管蛋白质组学技术已经发展的越来越成熟并在生命科学研究的各个领域取得了傲人的成果，但是面对蛋白质组学样本的自身复杂性和目前质谱仪采集速度和灵敏度的局限性，怎样提高样本分析通量、定量稳定性以及数据完整性，特别是在一些大队列样本的系统筛选以及临床应用中，目前仍然是一大挑战。
传统的蛋白质组学采用DDA（Data-dependent Acquisition，数据依赖采集）策略，在全扫描质谱图中，肽段信号被选择性碎裂，产生随机（MS/MS）质谱。尽管这种方法非常强大，但它随机选取目标的方式，总是偏向于那些信号最强的峰，因此会引起缺失值（Missing Value）的问题，并且在大规模样本分析中，这种缺陷会被放大。DIA（Data-independent Acquisition，数据非依赖采集）策略则是将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口，并循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测，因此可以无遗漏地获得样本中所有离子的全部碎片信息，缺失值更少。但传统DIA的数据采集策略会使得谱图高度复杂，给数据解析带来极大的挑战，并且其定量可靠性也存有一定的争议。
现在，这些久已存在的困难终于迎来了革命性的突破。就在今年，全球蛋白质组领域顶尖科学家Matthias Mann教授团队(Max Planck Institute, Martinsried)、Ruedi Aebersold教授团队（IMSB at ETH Zuerich）、Hannes Röst博士团队(University of Toronto)以及Ben Collins博士团队（Queen’s University Belfast）联合布鲁克共同开发基于4D平台的DIA技术——diaPASEF（研究成果在预印本网站bioRxiv发表并在第18届人类蛋白质组组织世界大会上（HUPO2019）展示）。全新的4D-DIA蛋白质组学能够全面提升蛋白质鉴定能力、检测灵敏度和数据完整性，展现了其在蛋白质组学领域的强大功能和广泛应用前景，具有划时代的重大意义。
依托于diaPASEF技术的4D-DIA蛋白质组学，同时集合了4D蛋白质组和DIA技术的优势，并克服了其原有的一些劣势，真正实现优势互补、“双剑合璧”。
在diaPASEF的扫描模式中，与离子淌度相关的CCS值和m/z之间有一定的相关性，因此四级杆可以利用这个特征逐步扫描来采集近乎100%的离子信号，极大提升检测的灵敏度和深度。而在DDA和传统的DIA模式中，这些信号只有一小部分可以被采集（图3）。
图3. 基于4D平台的diaPASEF技术可实现近乎100%的离子利用率
a，diaPASEF中的数据采集模式；b，diaPASEF和DDA及传统DIA离子利用率的对比。
除此之外，由于4D平台中新增的离子淌度分离，有效降低了谱图的复杂性，缓解了DIA技术中面临的最大困境。同时，由于同时具有CCS数值的对齐，进一步增强了定量的可靠性。
下面我们看一下4D-DIA技术在实际检测中的表现。根据实验测试结果，在200ng HeLa 裂解液的120分钟单针实验中，可以鉴定超过7500种蛋白质，并且三次实验的共同定量了6974个蛋白，数据完整性高达96%（图4a-c）；而相比之下，在传统的DIA技术中，通常需要µg级的样品才能检测约5000左右的蛋白。
图4. 4D-DIA分析HeLa细胞蛋白质组
基于卓越的仪器性能和先进的采集方法，4D-DIA技术还可以进一步挑战灵敏度的极限。从仅仅10ng HeLa 裂解液的120分钟单针实验中，能够鉴定到3323个蛋白，而相同实验条件下的4D-DDA模式只能鉴定到2723 个蛋白。而即便是在如此痕量的情况下，4D-DIA在蛋白质定量上也能实现了85％的数据完整性（图4）。
1. 近乎100%的离子利用率，提升检测灵敏度；
2. 更高的检测深度和覆盖度；
3. 定量重复性、完整性、可靠性全面提升。
凭借以上优势，4D-DIA技术特别适合于大规模样本的蛋白质组学分析，例如临床队列样本分析和作物群体性状的研究。
参考文献
Florian Meier, et al. (2019) Parallel accumulation – serial fragmentation combined with data-independent acquisition (diaPASEF): Bottom-up proteomics with near optimal ion usage. BioRxiv.
长按扫描二维码↓↓，了解更多【人工客服】、【项目查询】、及其他方法案例干货。
往期精彩回顾
TimsTOF Pro：景杰生物引进全球顶尖质谱仪timsTOF Pro
4D-LFQ：重磅！Matthias Mann发文，基于捕获离子淌度的新一代4D 蛋白质组学
第01课：投稿建议：写完文章往哪投？蛋白组学领域期刊介绍与投稿建议
第02课：上传组学数据：投稿前你需要知道的一件小事，如何上传组学原始数据？
第03课：制作火山图：简单两步，用Excel轻松搞定火山图
第04课：蛋白互作网络图：手把手教你做蛋白互作网络图
第05课：画韦恩图：教你轻松画韦恩图
全国巡讲点击预约：PTM BIO蛋白质组学与翻译后修饰2019全国巡讲，点击预约！